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ELISA直接法測(cè)長(zhǎng)葉車前花葉病毒(RMV)含量實(shí)驗(yàn)步驟
更新時(shí)間:2014-01-16 點(diǎn)擊次數(shù):1818次

ELISA直接法測(cè)長(zhǎng)葉車前花葉病毒(RMV)含量實(shí)驗(yàn)步驟

 

  1. 將不同濃度的待檢測(cè)RMV溶液作為樣品液,在測(cè)定板每孔各加250ul,至冰箱(4)中孵育過(guò)一夜。
  2. 孵育后,去除孔穴內(nèi)抗原溶液,用PBS-Tween20溶液緩緩沖洗孔穴3次,每次3min,然后去凈洗滌液。
  3. 每孔穴加250ulRMV的酶標(biāo)記抗體溶液(用1%牛血清白蛋白的PBS- ween20稀釋)在恒溫箱(37)里孵育3-6h,6℃下過(guò)夜。
  4. 去除孔穴酶標(biāo)記抗體溶液,用PBS-Tween20溶液緩緩沖洗3次每次3min,然后去凈洗滌液。
  5. 每孔穴加入新鮮配備的底物溶液250ul,室溫放置0.5h,或者放置出現(xiàn)黃色。
  6. 加入50ul3N NaOH,終止反應(yīng)。
  7. 對(duì)每孔穴的黃色溶液,測(cè)定449nm波長(zhǎng)處的吸光值。

討論

  1. 如該聚苯乙烯塑料微量反應(yīng)板*次使用,應(yīng)分別用標(biāo)準(zhǔn)濃度的RMV溶液、RMV的抗血清及RMV與它的IgG形成的免疫結(jié)合物,進(jìn)行期盼滴定法來(lái)測(cè)該聚苯乙烯塑料微量反應(yīng)板對(duì)RMV抗原和它的抗體的吸附能力。
  2. 在正式測(cè)樣品前,用0.1mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液配置各種標(biāo)準(zhǔn)濃度的RMV溶液,依照實(shí)驗(yàn)步驟測(cè)定RMV各種標(biāo)準(zhǔn)濃度的A449nm值,以病毒標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo),A449nm值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,由此可以測(cè)出RMV包被的濃度。
  3. 測(cè)出原始底物的吸光值,以便核準(zhǔn)數(shù)據(jù)。
  4. 對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線,就可算出樣品液中RMV的含量。
  5. 如無(wú)牛血清白蛋白,可用0.1%白明膠代替。
  6. 對(duì)于不穩(wěn)定的病毒,用中性緩沖液稀釋。
  7. 如有ELISA測(cè)定儀,可快速測(cè)定。

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