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乳酸(LA)含量檢測操作步驟
點擊次數(shù):6202 更新時間:2021-06-23

 

乳酸LA)含量檢測試劑盒說明書微量法

注意:正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。

規(guī)格:100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容:

提取液:液體50mL×1瓶,4℃保存;

試劑一:液體20mL×1瓶,4℃保存;

試劑粉劑×1,-20保存。臨用前加入0.6ml試劑一充分溶解??煞盅b后-20℃保存, 避免反復凍融;

試劑三:粉劑×1瓶,-20℃避光保存。臨用前加入6mL試劑一充分溶解;可分裝后-20℃保存,避免反復凍融;

試劑:粉劑×1瓶,-20℃避光保存。 臨用前每瓶加入6mL 試劑一混勻,可分裝后-20℃保存,避免反復凍融;

試劑:液體3mL×1瓶,4℃保存。

標準品:粉劑×1支,4℃保存。臨用前加入1.04mL提取液配成100µmol/mL 的標準溶液;

色液的配制:臨用前根據(jù)用量按照試劑三(V):試劑四(V):試劑V=110.5的比例充分混勻,現(xiàn)配現(xiàn)用;

產(chǎn)品說明:

乳酸是生物體代謝過程中重要的中間產(chǎn)物,與糖代謝、脂類代謝、蛋白質(zhì)代謝及細胞內(nèi)能量代謝密切相關,乳酸含量是評估糖元代謝的和有氧代謝的重要指標。乳酸在乳酸脫氫酶的作用下生成丙酮酸,同時使NAD+還原生成NADHH+,H+傳遞給PMS生成的PMSH2還原特異性底物, 450nm處有特征吸收峰。

自備實驗用品及儀器:

天平、研缽/勻漿器、離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、乙醇和蒸餾水。

操作步驟:

一、樣本處理:

  • 組織:按照質(zhì)量(g:提取液一體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g,加入1mL提取液加入提取液,冰浴勻漿后于4℃,12000g離心10min后取上清待測。

b. 細胞:按照細胞數(shù)量106:提取液一體積mL500~10001的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);4℃, 12000g離心10min后取上清待測。

c. 血清(漿):取100µL血清(漿)加入0.9mL提取液,412000g離心10min后取上清待測。

二、測定操作

1、分光光度計/酶標儀預熱30min,波長調(diào)至450nm,分光光度計用蒸餾水調(diào)零。

2、標準液的稀釋:將100µmol/mL 的標準溶液用蒸餾水稀釋為105、2.5、1.25、0.6250.3125、0µmol/mL的標準溶液待測。

3、加樣表:

 

測定管

對照管

標準管

空白管

樣品(µL

10

10

-

-

標準品(µL

-

-

10

-

蒸餾水(µL

-

10

-

10

試劑一(µL

40

40

40

40

試劑二(µL

10

-

10

10

工作液µL

140

140

140

140

37℃準確反應 30min。450nm 處測定吸光值,分別記為 A 測定管,A 對照管,A 標準管,A 空白管,計算?A 測定=A 測定管-A 對照管;?A 標準= A 標準管-A 空白管。

三、乳酸含量的計算:

1、標準曲線的繪制

以各標準溶液濃度為x軸,以其對應的吸光值(?A標準)為y軸,繪制標準曲線,得到標準方程

y=kx+b,將?A測定帶入公式中得到xµmol/mL)。2、乳酸含量計算

(1) 按照蛋白含量計算

LA含量(µmol/mg prot=x×V ÷V ÷Cpr =x÷Cpr

(2) 按照樣本質(zhì)量計算

LA含量µmol/g 鮮重=x×V ÷(V ÷V 樣總×W)=x ÷W。

(3) 按照細胞數(shù)量計算

LA含量(µmol/106 cell=x×V ÷(V ÷V 樣總×細胞數(shù)量)=x ÷細胞數(shù)量

(4) 按照液體體積計算

LA含量(µmol/mL= 10×x。

V樣品:加入的樣品體積,0.01mL。:W:樣本質(zhì)量,g/mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL 蛋白濃度需自行測定; V提取液:加入的提取液體積,1mL;細胞數(shù)量,5×106個;V液體:液體樣本體積,0.1mL。

注意事項:

1. 若測定吸光值?A大于最大濃度標準品OD,請將樣品體積進行適當?shù)南♂尯?/font>

再進行測定,并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

 

實驗代做服務:

 

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